體內(nèi)堿性彗星試驗原理及注意事項

體內(nèi)堿性彗星試驗在化合物遺傳毒性評價中的應(yīng)用日益廣泛。ICH S2(R1)已將肝臟彗星試驗列為第2個組織/終點的體內(nèi)試驗；體內(nèi)哺乳動物堿性彗星試驗的指導原則（TG489）也已頒布。體內(nèi)堿性彗星實驗能夠檢測DNA鏈斷裂、堿性不穩(wěn)定位點、不完整切除修復引起的DNA鏈的斷裂，能夠制成合適細胞懸液的組織DNA損傷。與其他試驗相比其檢測的是單細胞水平的DNA損傷，因此該試驗敏感性較高，操作簡單，經(jīng)濟省時。

實驗原理

彗星實驗（comet assay）也稱單細胞凝膠電泳試驗（single cell gel electrophoresis.SCGE）,是一種有效評估DNA損傷的方法。其原理是器官或組織經(jīng)處理（如輻射、重金屬等）后，細胞中的DNA發(fā)生單鏈或雙鏈斷裂，經(jīng)細胞及其核膜裂解后，DNA解旋，在電場作用下，DNA 斷片遷移出細胞核，形成彗星狀的電泳圖譜。正常細胞的大分子DNA在電場作用下遷移距離較短，DNA仍保留在細胞核的范圍，形成圓形或輕微拖尾的圖譜。根據(jù)電泳緩沖液的pH值不同，可分為中性彗星實驗（pH=8.4）和堿性彗星實驗（pH＞13）。中性彗星實驗主要用于檢測DNA雙鏈的斷裂損傷，堿性彗星實驗具有更高的靈敏性，可用于檢測更少量的單鏈和雙鏈斷裂損傷。

需要注意的是，試驗過程中的個方面，包括樣品準備、電泳條件、視覺分析參數(shù)(如染色強度、顯微鏡光強度以及使用顯微鏡濾鏡和相機動態(tài)和環(huán)境條件(如背景照明)已經(jīng)被研究，可能影響DNA遷移。

圖一：DNA損傷彗星細胞

圖二：正常細胞

堿性彗星實驗指導原則

TG489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay，2016，OECD Guideline for the Testing of Chemicals

試驗能力驗證

每個實驗室都應(yīng)證明能夠為所使用的目標組織獲得足夠質(zhì)量的單細胞或細胞懸浮液，從而在彗星試驗（comet assay）中建立實驗能力。匯智泰康擁有多年毒理學服務(wù)與產(chǎn)品研發(fā)經(jīng)驗，針對不同遺傳毒性試驗開發(fā)針對試劑盒，包括彗星試驗試劑盒。首先通過%尾DNA的評價，對照處理組動物%尾DNA在低范圍內(nèi)。目前的數(shù)據(jù)表明,尾部DNA百分比(基于平均中位數(shù))在大鼠肝臟應(yīng)該hao不要超過6%,這將是符合JaCVAM驗證試驗的值和其他出版和私有數(shù)據(jù)。目前還沒有足夠的數(shù)據(jù)對其他組織的jia或可接受范圍提出建議。這并不排除合理使用其他組織。測試報告應(yīng)根據(jù)已發(fā)表的文獻或?qū)Ｓ袛?shù)據(jù)，對彗星試驗在這些組織中的性能進行適當?shù)膶彶?。首先，在對照組中，需要一個較低的%尾DNA范圍，以提供足夠的動態(tài)范圍來檢測陽性的影響。其次，每個實驗室都應(yīng)能夠按照表1所建議的不同方式，對直接誘變劑和促進劑的反應(yīng)。

表一：陽性對照物質(zhì)及其部分靶組織

應(yīng)收集陰性對照數(shù)據(jù)，以證明陰性數(shù)據(jù)反應(yīng)的再現(xiàn)性，并確保對檢測的技術(shù)方面進行適當控制，或建議需要重新建立歷史控制范圍。

歷史對照

在實驗室能力驗證過程中，實驗室應(yīng)建立歷史數(shù)據(jù)庫，建立相關(guān)組織和物種的陽性和陰性對照范圍和分布。不同的組織和不同的物種，以及不同的給藥溶媒和給藥途徑，可能會產(chǎn)生不同的%尾DNA陰性對照值。因此，建立每個組織和物種的陰性對照范圍是很重要的。實驗室應(yīng)采用質(zhì)量控制方法，以確定其數(shù)據(jù)的變化程度，并表明該方法在其實驗室中得到了“控制”?？赡苓€需要優(yōu)化選擇適當?shù)年栃詫φ瘴镔|(zhì)、劑量范圍和實驗條件(例如電泳條件)，以便發(fā)現(xiàn)微弱的影響。

對實驗方案的任何更改都應(yīng)根據(jù)其與實驗室現(xiàn)有歷史控制數(shù)據(jù)庫的一致性加以考慮。任何重大的不一致都應(yīng)導致建立新的歷史控制數(shù)據(jù)庫。

方法描述

動物選擇：通常使用健康成年嚙齒動物(6-10周齡，但年齡稍大的動物也可接受)。然而，如果合乎倫理和科學，其他物種也可以被利用。

動物準備：動物隨機分為對照組和實驗組。在開始實驗前，這些動物適應(yīng)實驗室條件至少5天，給予標識識別。試驗開始時,動物的重量差異應(yīng)該不超過±20%。

樣品制備：在給動物給藥前，固體測試化學品應(yīng)溶解或懸浮在適當?shù)?/font>溶媒中，或混合在飲食或飲用水中。液體試驗化學品可直接加藥或在加藥前稀釋。對于吸入暴露，根據(jù)其物理化學性質(zhì)，試驗化學品可以作為氣體、蒸汽或固體/液體氣溶膠使用。

溶媒：在使用的劑量范圍內(nèi)，溶媒不應(yīng)產(chǎn)生毒性作用，也不應(yīng)與試驗物質(zhì)發(fā)生化學反應(yīng)。如果使用的不是常用溶媒應(yīng)提供參考數(shù)據(jù)，說明它們在測試動物、管理路線和終點方面的兼容性。建議在可能的情況下，應(yīng)首先考慮使用水性溶劑/溶媒。值得注意的是，一些溶劑可誘導炎癥反應(yīng)，增加接觸部位DNA鏈斷裂的背景水平，尤其是與多藥給藥時。

陰性對照：陰性對照動物，單獨用溶媒處理，其他處理方法與治療組相同，每一次采樣時間和組織的每次檢測均納入一組陰性對照動物。陰性對照動物的尾部DNA應(yīng)在每個組織預先設(shè)定的實驗室背景范圍和該物種的取樣時間內(nèi)。

動物數(shù)量和性別：目標是每組提供至少5只可分析的單性別動物，或如果使用兩種動物，則每組至少提供5只可分析的單性別動物。如果人類接觸到的化學物質(zhì)可能具有性別特異性，例如某些藥物，則應(yīng)在適當?shù)男詣e下進行檢測。三個劑量組和同時進行的陰性和陽性對照(每一組由5只單性別動物組成)，將需要25至35只動物。

試驗計劃：動物應(yīng)接受為期2天或以上的每日給藥(即每隔約24小時進行兩次或兩次以上)，并在后一次治療后的2-6小時采集一次樣本。延長劑量方案(如28天每日給藥)的樣本是可以接受的。測試化學品也可以分次使用，即，兩組給藥在同一天間隔不超過2-3小時，便于給藥量大。在這種情況下，取樣時間應(yīng)根據(jù)后一次給藥的時間來安排。

劑量水平：對無毒試驗化學品，給藥14天以上的，大(限)劑量為1000mg /kg體重/天。給藥時間少于14天，gao劑量為2000毫克/公斤體重/天。對于特定法規(guī)所涵蓋的特定類型的測試化學品(如人類藥物)，這些限制可能有所不同。在長期給藥后表現(xiàn)出毒物動力學性質(zhì)飽和或誘導排毒過程而可能導致接觸減少的物質(zhì)，可能是劑量設(shè)定標準的例外，應(yīng)逐個進行評估。

急性和亞急性的彗星試驗,除了大劑量(MTD,大可行的劑量,大接觸或限制劑量)遞減序列至少兩個額外的適當間隔的劑量水平(hao相隔不到√10)應(yīng)該選擇為每個采樣時間證明劑量相關(guān)的反應(yīng)。但是，所使用的劑量水平也hao包括從大限度到產(chǎn)生很少或沒有毒性的劑量范圍。當檢測到所有劑量水平的靶組織毒性時，建議進一步進行無毒劑量的研究。為了更全面地調(diào)查劑量-反應(yīng)曲線的形狀，可能需要進行研究。

在設(shè)計試驗時，應(yīng)考慮人體接觸的預期途徑。因此，暴露途徑，如飲食、飲水、局部、皮下、靜脈、口服(灌胃)、吸入、氣管內(nèi)或植入術(shù)可能是合理的。無論如何，應(yīng)選擇適當?shù)穆窂揭源_保目標組織得到充分暴露。腹腔注射通常不推薦使用，因為它不是典型的人體接觸的相關(guān)途徑，只能在有特定理由的情況下使用(例如，一些陽性對照物質(zhì)，用于調(diào)查目的，或用于腹腔注射途徑所使用的某些藥物)。一次灌胃或注射液體的大容量取決于試驗動物的大小。體積不應(yīng)超過1毫升/100克體重，但可使用2毫升/100克體重的水溶液除外。如果動物福利立法允許，使用比這更多的量是合理的。在可能的情況下，應(yīng)通過調(diào)整劑量配方的濃度來達到不同的劑量水平，以確保在所有劑量水平上的體積相對于體重是恒定的。

采樣時間：采樣時間是一個關(guān)鍵變量，因為它是由測試化學物質(zhì)在目標組織中達到大濃度所需的時間和DNA鏈斷裂的誘導時間決定的，但在這些斷裂被移除、修復或?qū)е录毎劳鲋?。彗星實驗?/font>comet assay）檢測到的一些導致DNA鏈斷裂的損傷持續(xù)時間可能很短，至少對于一些體外測試的物質(zhì)來說是這樣。因此，如果懷疑這種短暫的DNA損傷，應(yīng)采取措施減輕其損失，確保組織得到足夠早的采樣，可能早于下面給出的默認時間。jia采樣時間可能是特定于物質(zhì)或路徑的采樣時間，例如，靜脈給藥或吸入給藥導致組織快速暴露。因此，在可能的情況下，應(yīng)根據(jù)動力學數(shù)據(jù)(如血漿或組織濃度達到峰值的時間(Tmax)或多次給藥的穩(wěn)態(tài)時間(Cmax)確定采樣時間。在缺乏動能的測量數(shù)據(jù)合適的妥協(xié)基因毒性是樣品2-6 h后給藥兩次或兩次以上,或2-6和第16 - 26 h后。關(guān)于目標器官中毒性作用外觀的信息也可用于選擇適當?shù)娜訒r間。

組織收集：因為它可以研究誘導的DNA鏈斷裂(彗星)在任何組織中,組織選擇應(yīng)清晰、基于收集的原因進行研究與任何現(xiàn)有的基因毒性、致癌性或其他測試物質(zhì)的毒性數(shù)據(jù)在調(diào)查之中。應(yīng)考慮的重要因素應(yīng)包括給藥途徑、預測的組織分布和吸收、代謝的作用以及試驗物質(zhì)可能的作用機制。肝臟是研究頻繁、數(shù)據(jù)feng富的組織。因此，在缺乏任何背景信息的情況下，如果沒有確定感興趣的特定組織，那么對肝臟進行取樣是合理的，因為肝臟是異種生物代謝的主要場所，而且常常高度暴露于母體物質(zhì)和代謝物中。在某些情況下，直接接觸部位的檢查(例如，口服藥物，胃腺或十二指腸/空腸，或吸入藥物，肺)可能是相guan的。應(yīng)根據(jù)進行測試的具體原因選擇其他或替代組織，但如果實驗室已證明對這些組織的熟練程度和同時處理多個組織的能力，對同一動物的多個組織進行檢查可能是有用的。

樣本制備：在后一次用測試化學品后的適當時間，對動物實施安樂。收集選定的組織,而同時采集同一組織的一部分,放置在甲醛溶液或適當?shù)墓潭▌┛赡芙M織病理學分析。彗星實驗的組織被放置在切碎緩沖液中，用冷切碎緩沖液充分沖洗以去除殘留的血液，并儲存在冰冷的切碎緩沖液中，直到處理完畢。原位灌注也可進行，如肝、腎灌注。

玻片準備：單細胞懸液制備后，應(yīng)盡快(hao在1小時內(nèi))制備載玻片，但動物死亡與載玻片制備之間的溫度和時間應(yīng)嚴格控制，并在實驗室條件下進行驗證。向低熔點瓊脂糖(通常0.5-1.0%)中加入細胞懸浮液的體積，使玻片的低熔點瓊脂糖百分比不應(yīng)降低到0.45%以下。jia的細胞密度將由用來給彗星評分的圖像分析系統(tǒng)決定。

細胞裂解：裂解條件也是一個關(guān)鍵變量，可能會干擾特定類型的DNA修飾(某些DNA烷基化和堿基內(nèi)收)導致的鏈斷裂。因此，我們建議在實驗中對所有玻片的裂解條件盡可能保持恒定。準備好后，應(yīng)在約2-8攝氏度的弱光條件下(如黃光(或防光)，將載玻片浸入冷凍溶解液中至少1小時(或過夜)，以避免暴露在可能含有紫外線成分的白光下。在此潛伏期之后，在堿液展開步驟之前，應(yīng)沖洗載玻片以除去殘留的洗滌劑和鹽。這可以用純凈水、中和緩沖液或磷酸鹽緩沖液來完成。也可以使用電泳緩沖液。這將維持電泳室的堿性條件。

解旋和電泳：將載玻片隨機放置在含有足夠電泳溶液的潛電泳裝置的平臺上，使載玻片表面*覆蓋(每次覆蓋的深度也應(yīng)一致)。在其他類型的彗星試驗電泳裝置，即主動冷卻，循環(huán)和高容量電源，較高的解決方案覆蓋將導致更高的電流，而電壓保持不變。在電泳槽內(nèi)放置載玻片應(yīng)采用平衡設(shè)計，以減輕槽內(nèi)任何趨勢或邊緣效應(yīng)的影響，并盡量減少批與批之間的差異，即，在每次電泳中，研究中每個動物的載玻片數(shù)量應(yīng)相同，并應(yīng)包括來自不同劑量組(陰性和陽性對照)的樣本。應(yīng)該留給DNA解旋至少20分鐘,然后進行電泳受控條件下,測定的靈敏度和動態(tài)范圍da化(即導致尾部DNA百分比的可接受水平的正面和負面的控制靈敏度da化)。DNA遷移水平與電泳時間線性相關(guān)，也與電位(V/cm)線性相關(guān)。根據(jù)JaCVAM試驗，這可能是0.7 V/cm，持續(xù)至少20分鐘。電泳時間被認為是一個關(guān)鍵的變量，需要設(shè)置電泳時間來優(yōu)化動態(tài)范圍。較長的電泳時間(如30或40分鐘，以提高靈敏度)通常會導致較強的陽性反應(yīng)已知的誘變。然而，較長的電泳時間也可能導致過度遷移的控制樣本。在每個實驗中，電壓應(yīng)保持恒定，其他參數(shù)的變異性應(yīng)在一個較窄的指ding范圍內(nèi)。調(diào)節(jié)緩沖深度，達到要求，并在整個實驗過程中保持。應(yīng)記錄電泳開始和結(jié)束時的電流。因此，jia條件應(yīng)在實驗室中與所研究的每個組織有關(guān)的熟練程度的初步演示期間確定。通過展開和電泳的電泳溶液的溫度應(yīng)保持在低溫下，通常為2-10oC(10)。

電泳完成后，將載玻片在中和緩沖液中浸泡/沖洗至少5分鐘。凝膠可以被染色并標記為“新鮮”(例如在1-2天內(nèi))，也可以被脫水以便以后的標記(例如在染色后1-2周內(nèi))。但是，這些條件應(yīng)該在熟練程度的展示過程中得到驗證，并且應(yīng)該為每個條件分別獲得和保留歷史數(shù)據(jù)。如果是后者，則應(yīng)將玻片浸入無水乙醇中脫水至少5分鐘，風干，然后儲存在室溫或冰箱容器中。

測量方法：彗星應(yīng)該使用自動化或半自動化的圖像分析系統(tǒng)進行定量評分。用合適的熒光染色劑對載玻片進行染色，并在配備有超熒光和適當檢測器的顯微鏡或數(shù)碼相機上進行適當放大(如200x)的測量。

根據(jù)彗星圖像圖譜的描述，細胞可以分為三種類型，即可分析、不可分析和“刺猬。只有可分析的細胞(明確定義的頭部和尾部，不干擾相鄰的細胞)應(yīng)該為%的尾部DNA，以避免人為干擾。刺猬的頻率應(yīng)該根據(jù)每個樣本至少150個細胞的視覺評分(因為缺少一個清晰定義的頭部意味著它們不容易被圖像分析檢測到)來確定，并單獨記錄下來。

所有用于分析的玻片，包括陽性和陰性對照的玻片，都應(yīng)獨立編碼并進行“盲法”評分，以便評分者不知道情況。對于每個樣本(每個動物的每個組織)，至少應(yīng)該分析150個細胞(刺猬除外)。分析150細胞/動物至少5動物每劑，提供足夠的統(tǒng)計能力。

彗星DNA鏈斷裂可以通過尾DNA %、尾長和尾力矩等獨立端點來測量。如果使用適當?shù)膱D像軟件分析儀系統(tǒng)，就可以進行這三種測量。然而，推薦將%尾DNA(也稱為%尾強度)用于結(jié)果的評估和解釋，并由以細胞總強度百分比表示的尾DNA的片段強度決定。

數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷

在實驗條件下，陽性對照組的尾DNA%的與陰性對照相比具有統(tǒng)計學意義上的增加（p<0.05）時，判定試驗系統(tǒng)有效。

在試驗系統(tǒng)判定有效的前提下，同時滿足以下三個條件，則判定受試樣品為陽性結(jié)果：

（1） 尾DNA%的在某個單獨劑量組顯著升高；

（2） 尾DNA%隨試驗樣品濃度升高有顯著增加趨勢；

（3） 受試物組的尾DNA%全部超過陰性背景數(shù)據(jù)范圍。

在判定陽性結(jié)果時，如僅符合上述標準中的一個或兩個，除統(tǒng)計學意義外，還應(yīng)考慮其生物學意義。

如全部不符合上述3個，則判定為陰性結(jié)果。

試驗報告

試驗報告應(yīng)包括以下內(nèi)容：

（1）受試物來源如批號；

（2）測試化學品的穩(wěn)定性、使用限制日期或已知的重新分析日期;

（3）化學識別，如IUPAC或CAS名稱、CAS編號、SMILES或InChI代碼、結(jié)構(gòu)公式、純度、雜質(zhì)的化學識別(視情況和實際可行)等。

（4）多組分物質(zhì)，UVBCs和混合物, 盡可能用化學特性(見上文)、定量發(fā)生和表征化學成分的相關(guān)理化性質(zhì)。

（5）溶劑選擇的理由，已知測試化學品在溶劑/溶媒中的溶解性和穩(wěn)定性;劑量制劑的制備;對配方(例如穩(wěn)定性、均勻性、名義濃度)的分析測定;

（6）實驗動物：所使用的品種，以及作出選擇的科學和倫理理由;動物的數(shù)目、年齡和性別;來源、居住條件、飲食、營養(yǎng)等;試驗開始和結(jié)束時動物的體重，包括每組動物體重的范圍、平均值和標準差;

（7）測試條件：陽性和陰性控制數(shù)據(jù);測距研究的結(jié)果(如進行);劑量水平選擇的理由;測試化學制劑的詳細資料;測試化學品的管理詳情;行政路線的基本原理;注射部位(用于皮下或靜脈注射研究);樣品制備方法，如有，組織病理學分析，特別是對彗星反應(yīng)陽性的物質(zhì);

（8組織選擇的基本原理;

如果檢測結(jié)果為陰性，則驗證該測試化學品是否達到目標組織或一般循環(huán)的方法;

根據(jù)膳食/飲用水試驗化學濃度(ppm)和消耗量(如適用)計算的實際劑量(mg/kg體重/日);

飲食及水質(zhì)詳情;詳細說明實驗方案和取樣計劃以及選擇的理由(如有毒物動力學數(shù)據(jù));-止痛、鎮(zhèn)痛方法;-安樂的方法;分離和保存組織的程序;制備單細胞懸液的方法;所有試劑的來源和批號(如有可能);評價細胞毒性的方法;電泳條件;使用染色技術(shù)；評價和測量彗星的方法;

（9）結(jié)果:對每只動物在試驗前和整個試驗期間進行一般臨床觀察(如有);進行細胞毒性試驗的證據(jù);超過一周的研究:研究期間的個體體重，包括各組體重范圍、平均值和標準差; 劑量-反應(yīng)關(guān)系明顯;對于每個組織/動物，%的尾部DNA(或其他測量方法，如果選擇)和每張玻片的中位數(shù)，每只動物的平均值和每組的平均值;同步和歷史陰性對照數(shù)據(jù)，包括評估的每個組織的范圍、平均值/中位數(shù)和標準差;并發(fā)和歷史正控制數(shù)據(jù);對于肝臟以外的組織，使用陽性對照的劑量-反應(yīng)曲線。

（10）應(yīng)用的統(tǒng)計分析和方法; 

（11）討論結(jié)果和結(jié)論

彗星試驗試劑盒

北京匯智泰康針對堿性彗星試驗開發(fā)彗星試驗試劑盒，本試劑盒提供了彗星試驗（單細胞凝膠電泳試驗）需要的主要試劑盒耗材，省去了細胞裂解液、細胞懸液、堿性電泳液、電溶膠配制等時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期；試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測和多次試驗驗證，符合堿性彗星試驗要求，實驗結(jié)果準確、可靠、重現(xiàn)性高。

堿性彗星試劑盒應(yīng)用廣泛，可進行食品與飲用水、化學品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個方面的遺傳毒性檢測評價。

【產(chǎn)品說明】

  本試劑盒提供了單細胞凝膠電泳試驗（single cell gel electrophoresis,SCGE）需要的試劑和耗材。

• 細胞裂解液避免了多成分配制的繁瑣工藝，保證了每次實驗細胞裂解的穩(wěn)定性。
• 電泳膠經(jīng)過采用先進工藝規(guī)模化制備，出廠前經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，實驗時直接溶解即可使用。
• 針對實驗設(shè)計的兩孔式玻片增加了溶膠的粘附性，使細胞完整，便于拍照分析。

【試劑盒應(yīng)用范圍】

本試劑盒應(yīng)用范圍非常廣，可進行食品與飲用水、化學品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝 材料等遺傳毒理學檢測。

【傳統(tǒng)試驗操作不足】

• 溶液配制繁瑣，每次配制裂解效果不同。
• 不同膠濃度會影響DNA尾百分數(shù)，過低濃度的膠穩(wěn)定性差，過高濃度的膠會抑制彗星尾的產(chǎn)生，且反復溶膠會導致儲備液蒸發(fā)，影響試驗結(jié)果。
• 傳統(tǒng)玻片對溶膠的粘附性較低，且溶膠易流出玻片，損失較大。

【試劑盒優(yōu)勢】

便捷—— 本試劑盒省去了裂解液配制時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期。

準確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，實驗結(jié)果準確、可靠、重現(xiàn)性高。

穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強、易于運輸和保存。

【產(chǎn)品使用說明】

儀器和設(shè)備

干熱烤箱、低溫冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、雙穩(wěn)定電泳儀、電泳槽、倒置熒光顯微鏡和低速冷凍離心機等。

試劑配制

實驗開始前，請根據(jù)說明書要求自行準備實驗所需試劑及耗材。   

注：可根據(jù)實驗實際需求改變試劑的配制量。

單細胞懸液制備

（1）懸浮細胞：細胞懸浮液經(jīng)離心分離獲得。將細胞以1×10⁵個/ml的速度懸浮于1X PBS(不含Ca+和Mg+)中。

（2）貼壁細胞：輕輕從皿底分離細胞。將細胞和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到離心管中，進行細胞計數(shù)。用1X PBS (不含Ca+和Mg+)冰洗一次。將細胞以1×10⁵個/ml的速度懸浮于1X PBS(不含Ca+和Mg+)中。

（3）組織制備：稱取組織約0.05 g，加入制備緩沖液（含20 mmol/L EDTA-Na2的PBS）立即剪碎，沖洗。迅速研磨組織，過濾，整個過程在冰上操作。離心重懸，計數(shù)單細胞懸液密度約在為1×10⁵～4×10⁵個/mL。

制片、裂解、解旋及電泳

（1）取120μL濃度為電泳膠A趁熱鋪于磨砂載玻片上，形成底膠，用蓋玻片推勻，不能有氣泡，4℃凝固20min。

（2）水平取下蓋片，取80 μL電泳膠B與20μl細胞懸液混勻，立即鋪片，加上蓋玻片，4℃凝固5min，形成第二層膠。再取80μL電泳膠B鋪在第二層膠上，4℃凝固5min，形成第三層膠。保證細胞均勻分布于每孔，每個樣本平行2孔。

（3）細胞裂解

將玻片置于平皿中，加入預冷的裂解液（裂解液：DMSO=10:1），4℃過夜裂解，裂解液平面剛好沒過玻片表面。裂解后，倒掉裂解液，用超純水清洗3次，5min/次。

4、解旋

加入預冷的解旋液（pH＞13）沒過玻片，4℃避光解旋1h。

5、電泳

預先將電泳槽置于冰盒內(nèi)，冷卻備用。將解璇后的細胞玻片置于電泳槽，倒入電泳液，調(diào)整電壓 22-24V，電流約為300Ma，電泳20min。電泳結(jié)束后，取出玻片，輕輕擦拭，去除多余液體。

超純水清洗2遍，無水乙醇脫水1遍，5min/次。37℃烘干。

染色、拍照及分析

染色時將稀釋過的Gene Red : Tris-Hcl 1:6000，加到玻片每孔表面，每孔100μL，避光染色30分鐘。超純水清洗3遍，去除多余液體，37℃烘干或室溫避光晾干。

拍照前關(guān)閉實驗室光源，使用CASP1.2.3beta2彗星圖像分析軟件進行分析，每只動物都要分析150個可分析的尾DNA含量百分率的中位數(shù)。分析過程中如遇刺猬細胞進行標記。

【注意事項】

1.本試劑盒僅供科研使用，不可用于診斷程序。

2.實驗開始前，請自行準備DMSO、超純水、手術(shù)器械、篩網(wǎng)、無水乙醇、染色液、水平電泳槽等。

3.使用組織進行彗星試驗時，需注意細胞制備需全程在冰上進行，且保證在1 h內(nèi)完成鋪片。

4.電泳膠使用時需提前水浴融化，禁用微波。

5.因各實驗室條件不同，各種激發(fā)光源所需染色液各異，本試劑盒未提供染色液。推薦的染色液包括但不局限于Gene Red、SYBR Green、SYBR Gold等。

6.清洗玻片時注意不要直接將液體傾倒至膠面，防止脫膠。

圖1 陽性對照                                     圖2 陰性對照

注：附圖僅供參考，以實際為準。

常見問題及原因分析

1. 大鼠麻醉處死后，取肝臟樣品制備要注意肝的保存溫度及保存時間、冷凍組織以及一些其他諸如取樣所用緩沖溶液、所取肝臟組織大小等因素。取好的肝臟在制成單細胞懸液前多在冰上保存1h。一半彗星實驗所取的肝臟大小約為0.05cm³。

2. 如需將組織冷凍，應(yīng)將組織取出后迅速并深度冷凍，直至制備單細胞懸液時取出。

3. 解旋時間會影響DNA尾百分數(shù)，DNA尾百分數(shù)隨著解旋時間的延長而增長。

4. 電泳時間會影響DNA尾百分數(shù)，細胞DNA遷移隨著電泳時間的增長二增長?？梢酝ㄟ^改變電壓提高試驗的靈敏度，推薦電壓為0.7V/cm。

5. 如有其他技術(shù)問題，可聯(lián)系匯智泰康。