體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞TK基因突變試驗(yàn)方法及導(dǎo)則

TK基因突變?cè)囼?yàn)的檢測(cè)終點(diǎn)是TK基因的突變。TK基因突變屬于常染色體基因突變。TK基因的產(chǎn)物胸苷激酶在體內(nèi)催化從脫氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反應(yīng)。在正常情況下，此反應(yīng)并非生命所必需，原因是體內(nèi)的TMP主要來(lái)自于脫氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反應(yīng)生成TMP。但如在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入胸苷類(lèi)似物(如三氟胸苷,即trifluorothymidine,TFT)，則TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，進(jìn)而摻入DNA，造成致死性突變,故細(xì)胞不能存活。若TK基因發(fā)生突變，導(dǎo)致胸苷激酶缺陷,則TFT不能磷酸化，亦不能摻DNA，故突變細(xì)胞在含有TFT的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)，即表現(xiàn)出對(duì)TFT的抗性。根據(jù)突變集落形成數(shù)可計(jì)算突變頻率，從而推斷受試物的致突變性。在TK基因突變?cè)囼?yàn)結(jié)果觀察中可發(fā)現(xiàn)兩類(lèi)明顯不同集落，即大/小集落(L5178Y細(xì)胞)或正常生長(zhǎng)/緩慢生長(zhǎng)集落(TK6細(xì)胞)，有研究表明，大集落/正常生長(zhǎng)集落主要由點(diǎn)突變或較小范圍的缺失等引起，而小集落/緩慢生長(zhǎng)集落主要由較大范圍的染色體畸變，或由涉及調(diào)控細(xì)胞增殖的基因缺失引起。

北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對(duì)小鼠淋巴瘤細(xì)胞TK基因突變?cè)囼?yàn)開(kāi)發(fā)染TK基因突變?cè)噭┖校驹噭┖嗅槍?duì)小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Y開(kāi)展TK基因突變?cè)囼?yàn)，試劑盒省去了陽(yáng)性底物成分、篩選培養(yǎng)基準(zhǔn)備、誘導(dǎo) S9 制備，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期；試劑盒各成分均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，無(wú)雜菌污染，誘導(dǎo) S9 活性均符合小鼠淋巴瘤細(xì)胞TK基因突變?cè)囼?yàn)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。染色體畸變?cè)囼?yàn)試劑盒應(yīng)用廣泛，可進(jìn)行食品、化學(xué)品、農(nóng)藥、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個(gè)方面的遺傳毒理學(xué)檢測(cè)。

TK基因突變?cè)囼?yàn)導(dǎo)則

1  范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了體外哺乳類(lèi)胸苷激旃(thymidine kinase TK)基因突變?cè)囼?yàn)的基本試驗(yàn)方法與技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于評(píng)價(jià)受試物的致突變作用術(shù)語(yǔ)和定義TK基因哺乳類(lèi)動(dòng)物的胸苷激基因。

2  術(shù)語(yǔ)和定義

2.1  TK基因

人類(lèi)的TK基因定位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂遠(yuǎn)端；小鼠的則定位于號(hào)染色體。

2.2  突變頻率

在某種細(xì)胞系中，某一特定基因突變型的細(xì)胞(集落)占細(xì)胞(集落)總數(shù)的比例(單位通常為10^-6)。

3  原理

TK基因突變?cè)囼?yàn)的檢測(cè)終點(diǎn)是TK基因的突變。TK基因突變屬于常染色體基因突變。

TK基因的產(chǎn)物胸苷激酶在體內(nèi)催化從脫氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反應(yīng)。在正常情況下，此反應(yīng)并非生命所必需，原因是體內(nèi)的TMP主要來(lái)自于脫氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反應(yīng)生成TMP。但如在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入胸苷類(lèi)似物(如三氟胸苷,即trifluorothymidine,TFT)，則TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，進(jìn)而摻入DNA，造成致死性突變,故細(xì)胞不能存活。若TK基因發(fā)生突變，導(dǎo)致胸苷激酶缺陷,則TFT不能磷酸化，亦不能摻DNA，故突變細(xì)胞在含有TFT的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)，即表現(xiàn)出對(duì)TFT的抗性。根據(jù)突變集落形成數(shù)可計(jì)算突變頻率，從而推斷受試物的致突變性。在TK基因突變?cè)囼?yàn)結(jié)果觀察中可發(fā)現(xiàn)兩類(lèi)明顯不同集落，即大/小集落(L5178Y細(xì)胞)或正常生長(zhǎng)/緩慢生長(zhǎng)集落(TK6細(xì)胞)，有研究表明，大集落/正常生長(zhǎng)集落主要由點(diǎn)突變或較小范圍的缺失等引起，而小集落/緩慢生長(zhǎng)集落主要由較大范圍的染色體畸變，或由涉及調(diào)控細(xì)胞增殖的基因缺失引起。

4  儀器和設(shè)備

   培養(yǎng)箱、恒溫水浴、二氧化碳培養(yǎng)箱、壓力蒸汽消毒器、、低溫冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、生物安全柜、倒置顯微鏡、離心機(jī)、無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶，玻璃器皿等。

5  培養(yǎng)基

5.1  *培養(yǎng)基

RPMI1640培養(yǎng)液，加入10%馬血清(培養(yǎng)瓶培養(yǎng))或20%馬血清(96孔板培養(yǎng))及適量抗菌素(青霉素、鏈霉素的終濃度分別為100IU/mL及100μg/mL。

5.2  THMG和TMG選擇培養(yǎng)基THMG培養(yǎng)基

THMG培養(yǎng)基：3μg/mL胸腺嘧啶核苷( thymidine,T)+5μg/mL次黃嘌呤( hypoxanthine,H)+0.1μg/mL氨甲喋昤( methotrexate,M)+7.5μg/mL甘氨酸( glycine,G)。

THG培養(yǎng)基：3μg/mL胸腺嘧啶核苷(T)+5μg/mL次黃嘌昤(H)+7.5μg/mL甘氨酸(G)。

以上濃度為各試劑在培養(yǎng)基中的終濃度。實(shí)際試驗(yàn)中,常按照表1的方法把THMG和THG配成100倍濃度，在試劑盒中即為100倍濃度。

6  試驗(yàn)方法

6.1  細(xì)胞和培養(yǎng)條件

TK^+/-型的L5178Y-3.7.2C小鼠淋巴瘤細(xì)胞或TK6人類(lèi)淋巴母細(xì)胞。

兩種細(xì)胞均在5%二氧化碳、37℃、飽和濕度條件下作常規(guī)懸浮培養(yǎng)。

為避免在培養(yǎng)和傳代期間自發(fā)突變的細(xì)胞對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，在正式試驗(yàn)前，應(yīng)清除自發(fā)突變的TK^-/-基因型細(xì)胞。方法是：

a) 對(duì)于L5178Y細(xì)胞，使用THMG培養(yǎng)基處理24h，以800r/min~1000r/minm的速度離心4~6min、洗滌后在不含氨甲喋呤的THG培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d；

b) 對(duì)于TK6細(xì)胞,使用CHAT培養(yǎng)基處理48h，以800r/min~1000r/min的速度離心4~6min、洗滌后在不含氨基喋呤的CHT培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3d。

6.2  受試物

6.2.1  受試物的配制

固體受試物應(yīng)溶于或懸浮于適當(dāng)?shù)娜軇┗蛸x形劑中，在處理細(xì)胞前適當(dāng)稀釋。液體受試物可直接加至試驗(yàn)系統(tǒng)和或于染毒前稀釋。應(yīng)該使用新鮮制備的受試物，除非穩(wěn)定性資料證實(shí)可以貯存。

6.2.2  受試物劑量設(shè)定

至少應(yīng)設(shè)置3個(gè)~4個(gè)可供分析的濃度。對(duì)于有細(xì)胞毒性的受試物，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞毒性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果在RS或RSG為20%~80%范圍內(nèi)設(shè)3個(gè)~4個(gè)劑量(濃度)水平，同時(shí)應(yīng)該考慮受試物對(duì)溶解度、pH和摩爾滲透壓濃度的影響。方法是：取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，調(diào)整密度為5×10⁵/mL,按1%體積加入不同濃度受試物，37℃震搖處理3h(L5178Y細(xì)胞)或4h(TK6細(xì)胞)，細(xì)胞經(jīng)離心洗滌后，作2d(L5178Y細(xì)胞)或3d(TK6細(xì)胞)表達(dá)培養(yǎng)，每天計(jì)數(shù)細(xì)胞密度并計(jì)算相對(duì)懸浮生長(zhǎng)(RSG)。或取上述處理后細(xì)胞懸液，作梯度稀釋至8個(gè)細(xì)胞/mL，接種96孔板(每孔加0.2mL,即平均1,6個(gè)細(xì)胞/孔),每個(gè)劑量種1塊~2塊平板,，37℃，5%二氧化碳，飽和濕度條件下培養(yǎng)12d，計(jì)數(shù)每塊平板有集落生長(zhǎng)的孔數(shù)，計(jì)算相對(duì)存活率(RS)。

對(duì)于細(xì)胞毒性極低的受試物，gao濃度應(yīng)設(shè)為5mg/ mL、5uL/mL或0.01mol/L.。對(duì)于相對(duì)不溶解的物質(zhì)，其gao濃度的設(shè)置應(yīng)達(dá)到不影響細(xì)胞培養(yǎng)的大可加入濃度。

6.2.3  對(duì)照

一般情況下，每一項(xiàng)試驗(yàn)中，在代謝活化系統(tǒng)存在和不存在的條件下均應(yīng)設(shè)陽(yáng)性和陰性(溶媒)對(duì)照瓶組。

當(dāng)使用代謝活化系統(tǒng)時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照物應(yīng)使用要求代謝活化、并能引起典型突變集落的物質(zhì)，可以使用3-甲基膽(3- methyleholanthrene)、環(huán)磷酰胺( cyclophosphamide,CP)等。在沒(méi)有代謝活化系統(tǒng)時(shí)陽(yáng)性對(duì)照物可使用甲基磺酸甲酯( methyl methane sulfonate,MMS)、絲裂莓素C( mitomycin C,MMC)、甲基磺酸乙酯( ethylmethane sulfonate,EMS)等使用其他適宜的陽(yáng)性對(duì)照物。

溶媒應(yīng)是非致突變物，不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不影響細(xì)胞存活和S9活性。溶媒首先選擇蒸餾水，如使用非水溶媒（可選擇二甲基亞砜、丙酮、乙醇等），則需增設(shè)溶媒對(duì)照。

6.3  處理

取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，調(diào)整密度為5×10⁵/mL，按1%體積加入受試物(需代謝活化的情況下，同時(shí)加終濃度為10%的S9混合物)，37℃振搖處理3h（L5178Y細(xì)胞）或4h(TK6細(xì)胞)，以800~100r/min的速度離心4min-6min，棄上清液，用PBS或不含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2遍，重新懸浮細(xì)胞于含10%馬血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，并調(diào)整細(xì)胞密度為2×10⁵/mL。

6.4  PE₀（0d的平板接種效率）測(cè)定

取適量細(xì)胞懸液，作梯度稀釋至8個(gè)細(xì)胞/mL，接種96孔板(每孔加0.2mL，即平均1.6個(gè)細(xì)胞/孔)，每個(gè)劑量種1塊~2塊平板，37℃，5%二氧化碳，飽和濕度條件下培養(yǎng)12d。計(jì)數(shù)每塊平板有集落生長(zhǎng)的孔數(shù)。

6.5  表達(dá)

取6.3所得細(xì)胞懸液，作2d(1L5178Y細(xì)胞)或3d(TK6細(xì)胞)表達(dá)培養(yǎng)，每天計(jì)數(shù)細(xì)胞密度并保持密度在10⁶/mL以下，計(jì)算相對(duì)懸浮生長(zhǎng)(RSG)。

6.6  PE₂(L5178Y細(xì)胞)或PE₃ (TK6細(xì)胞)測(cè)定

表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后,取適量細(xì)胞懸液,按6.4方法測(cè)定PE₂/ PE₃。

6.7  突變頻率（MF）測(cè)定

6.7.1  L5178Y細(xì)胞

L5178Y細(xì)胞表達(dá)培養(yǎng)2d后，取適量細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁴/mL，加人TFT(終濃度為3ug/mL.)，混勻，接種96孔板(每孔加0.2mL，即平均2000個(gè)細(xì)胞/孔)，每個(gè)劑量作2塊~4塊板，37℃，5%二氧化碳，飽和濕度條件下培養(yǎng)12d，計(jì)數(shù)有突變集落生長(zhǎng)的孔數(shù)。突變集落按大集落Large Colony,LC：直徑≥1/4孔徑，密度低)和小集落(small colony，SC：直徑<1/4孔徑，密度高)分別計(jì)數(shù)。極小集落可再繼續(xù)培養(yǎng)3d后計(jì)數(shù).

7  大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)和S₉的制備

7.1  誘導(dǎo)

廣泛應(yīng)用的大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)劑是多氯聯(lián)苯（PCB混合物），選擇健康雄性大鼠體重200g左右，一次腹腔注射誘導(dǎo)劑，劑量為500mg/kg體重。誘導(dǎo)劑溶于玉米油中，濃度為200mg/mL。苯巴bi妥鈉和β-萘黃酮結(jié)合也可做為誘導(dǎo)劑。

•  S₉制備

動(dòng)物誘導(dǎo)后第五日斷頭處死。處死前12h停止飲食，但可自由飲水。首先，用75%酒精消毒動(dòng)物皮毛，剖開(kāi)腹部。在無(wú)菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結(jié)締組織，用冰浴的0.15mol/L氯化甲溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/L氯化甲溶液的燒杯里。按每克肝臟加入0.15mol/L氯化甲溶液3mL。用電動(dòng)勻漿器制成肝勻漿，再在低溫高速離心機(jī)上，在4℃條件下，以9000g離心10min，取其上清液（S₉）分裝于塑料管中。每管裝2 mL ~3 mL。儲(chǔ)存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中備用。

上述全部操作均在冰水浴中和無(wú)菌條件下進(jìn)行。制備肝S₉所用一切手術(shù)器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。S₉制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進(jìn)行鑒定。大鼠肝微粒體肝S9制備過(guò)程時(shí)間較久，也可以直接聯(lián)系北京匯智泰康購(gòu)買(mǎi)現(xiàn)有肝微粒體，肝S9，NADPH再生系統(tǒng)，UGT孵育系統(tǒng)等產(chǎn)品。

8  數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評(píng)價(jià)

8.1  數(shù)據(jù)處理

8.1.1  平板效率（PE₀、PE₂）

其中，EW為無(wú)集落孔數(shù)，TW為總的孔數(shù)，1.6為每孔接種細(xì)胞數(shù)。

8.1.2  相對(duì)存活率（RS）：

8.1.3  相對(duì)懸浮生長(zhǎng)（RSG）每日細(xì)胞增長(zhǎng)率（DGG）：

8.1.4  相對(duì)懸浮生長(zhǎng)（RSG）

8.1.5  相對(duì)總生長(zhǎng)（relative total growth，RTG）

其中，RSn 第2天（L5178Y細(xì)胞）的相對(duì)存活率。

8.1.6  突變頻率（MF）

其中，EW——96孔板無(wú)集落孔數(shù)；

TW——96孔板總的孔數(shù)；

N——每孔接種細(xì)胞數(shù)（此處N=2000），

PE2——第2天L5178Y細(xì)胞的平板效率。

此外，對(duì)于L5178Y細(xì)胞，可分別計(jì)算大集落突變率(L-MF)、小集落突變頻率(S-MF)和總突變頻率(T-MF)。對(duì)于TK6細(xì)胞，可分別計(jì)算正常集落突變頻率(N-MF)，緩慢生長(zhǎng)集落突變頻率S-MF)和總突變頻率(T-MF)。

8.1.7  小集落突變百分率

8.2  結(jié)果評(píng)價(jià)

8.2.1  試驗(yàn)成立條件

試驗(yàn)所用L5178Y細(xì)胞的自發(fā)突変頻率應(yīng)在50X10^-6~200X10^-6之間；TK6細(xì)胞的自發(fā)突變頻率應(yīng)在1.5X10^-6~5.5X10^-6之間，同時(shí)自發(fā)突變頻率應(yīng)在本實(shí)驗(yàn)室歷史記錄范圍內(nèi)。陰性/溶媒對(duì)照的PE₀在60%~140%之間，PE₂/ PE₃的值在70%~130%之間。陽(yáng)性對(duì)照的T-MF與陰性/溶媒對(duì)照有顯著差異，或是陰性/溶媒對(duì)照3倍以上。

8.2.2  受試物陽(yáng)性和陰性結(jié)果的判定

與陰性照組相比較，在所有染毒條件下，一個(gè)或多個(gè)劑量水平上基因突變頻率差值超過(guò)126.0×10-6（總評(píng)價(jià)因子，GEF）。

試驗(yàn)樣品所誘發(fā)的基因突變頻率出現(xiàn)濃度依賴(lài)性的增加。 

結(jié)果同時(shí)滿(mǎn)足上述標(biāo)準(zhǔn)，判定為陽(yáng)性結(jié)果；否則，判定為陰性結(jié)果

•  試驗(yàn)的解釋

TK基因突變?cè)囼?yàn)具有較高的敏感性，可檢出包括點(diǎn)突變、大的缺失、重組、異倍體和其他較大范圍基因組改變?cè)趦?nèi)的多種遺傳改變，長(zhǎng)時(shí)間處理還可檢出某些斷裂劑、紡錘體毒物和多倍體誘導(dǎo)劑等。但體外試驗(yàn)不能*模擬哺乳動(dòng)物體內(nèi)代謝條件，因此，本試驗(yàn)結(jié)果不能直接外推到哺乳動(dòng)物。陽(yáng)性結(jié)果表明受試樣品在該試驗(yàn)條件下可引起所用哺乳類(lèi)細(xì)胞基因突變；陰性結(jié)果表明在該試驗(yàn)條件下受試樣品不引起所用哺乳類(lèi)細(xì)胞基因突變。評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)綜合考慮生物學(xué)意義和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
匯智泰康TK基因突變?cè)噭┖袃?yōu)勢(shì)
北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對(duì)小鼠淋巴瘤細(xì)胞TK基因突變?cè)囼?yàn)開(kāi)發(fā)染TK基因突變?cè)噭┖小?/span>

便捷—— 本試劑盒省去了誘導(dǎo) S9 制備，陽(yáng)性底物、篩選培養(yǎng)基的配制和濃度條件摸索的時(shí)間，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。 準(zhǔn)確——本試劑盒各成分均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，無(wú)雜菌污染，誘導(dǎo) S9 活性均符合L5178Y細(xì)胞基因突變試驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。
穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強(qiáng)、易于運(yùn)輸和保存。

常見(jiàn)問(wèn)題及原因分析
1、細(xì)胞自發(fā)突變范圍不在5010^-6~20010^-6之間：需要再做一次細(xì)胞自發(fā)突變清除，直至自發(fā)突變?cè)?/span> 5010^-6~20010^-6
2、工作量較大：可以將有代謝活化和無(wú)代謝活化試驗(yàn)分開(kāi)進(jìn)行，減小工作量，確保試驗(yàn)準(zhǔn)確性。

TK基因突變?cè)噭┖惺褂谜f(shuō)明書(shū)

【試驗(yàn)原理】

TK基因突變?cè)囼?yàn)的檢測(cè)終點(diǎn)是TK基因的突變。在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入三氟胸苷（TFT），則TFT在胸苷激酶的催化下生成三氟胸苷酸，進(jìn)而參入DNA，造成致死性突變，細(xì)胞不能存活；若TK基因發(fā)生突變，導(dǎo)致細(xì)胞胸苷激酶（TK）缺陷，則TFT不能磷酸化，亦不能摻入DNA，突變細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)TFT抗性，在TFT存在條件下仍能生長(zhǎng)。在有或無(wú)代謝活化的條件下，將細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于受試物適當(dāng)時(shí)間，經(jīng)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時(shí)間，計(jì)數(shù)集落，計(jì)算突變頻率，從而推斷受試物致突變性。

【產(chǎn)品說(shuō)明】

匯智泰康TK基因突變試劑盒提供進(jìn)行體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞TK基因突變?cè)囼?yàn)所需的主要試劑和細(xì)胞，可用于評(píng)價(jià)受試物的致突變作用。其中所用細(xì)胞和試劑均符合國(guó)標(biāo)要求，且在國(guó)標(biāo)的基礎(chǔ)上引入了MTT染色法，使的結(jié)果觀察更為直觀，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性提供了支持。

【產(chǎn)品使用說(shuō)明】

1、細(xì)胞復(fù)蘇

從-70冰箱取出細(xì)胞，于37℃水浴融化，1000rpm離心5min，棄上清，用含10%馬血清、0.2mg/mL丙酮酸鈉的RPMI 1640培養(yǎng)液（RPMI-10）中重懸細(xì)胞；1000rpm再次離心5min，棄上清，用RPMI-10重懸后接種于細(xì)胞瓶中培養(yǎng)。

2、自發(fā)突變細(xì)胞清除

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液，于含1% 的THMG（100×）的*培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，1000 r/min離心5 min，洗滌后于含1%的THG（100×）*培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2 d。

注：為確保試驗(yàn)的可行性，試驗(yàn)中所用細(xì)胞的自發(fā)突變率應(yīng)在5010^-6~20010^-6之間，清除自發(fā)突變的細(xì)胞傳代使用不得超過(guò)1個(gè)月，每次試驗(yàn)前需將細(xì)胞清除自發(fā)突變。

3、染毒處理

取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10⁵個(gè)/mL（細(xì)胞數(shù)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況做調(diào)整），在加或不加代謝活化系統(tǒng)的條件下，按1%的體積加入不同濃度的受試物，37℃，70 rpm/min染毒處理3h，每個(gè)試驗(yàn)組平行處理兩份培養(yǎng)物。

（1）S9混合液及染毒用細(xì)胞液配制

注：在試驗(yàn)過(guò)程中，需根據(jù)實(shí)際需求，調(diào)整配制量。

（2）推薦染毒培養(yǎng)體系配制方案（以4個(gè)受試物劑量組為例）

注：染毒時(shí)間可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，一般為3h~6h，必要時(shí)可延長(zhǎng)到1個(gè)或多個(gè)細(xì)胞周期。若需進(jìn)行24小時(shí)染毒，所用陽(yáng)性底物需稀釋3倍后再加入。

4、表達(dá)培養(yǎng)

染毒細(xì)胞經(jīng)離心洗滌后，重懸細(xì)于RPMI-10培養(yǎng)液中，于在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中表達(dá)培養(yǎng)2 d。每天測(cè)定細(xì)胞密度，計(jì)算懸浮生長(zhǎng)（SG）、相對(duì)懸浮生長(zhǎng)（RSG）和細(xì)胞相對(duì)總生長(zhǎng)（RTG），具體方法可參照國(guó)標(biāo)方法要求。

5、突變頻率測(cè)定

表達(dá)培養(yǎng)2天后，用含20%馬血清、0.2mg/mL丙酮酸鈉的RPMI 1640培養(yǎng)液（RPMI-20）重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁴個(gè)/mL，加入TFT（終濃度3 μg/mL），混勻，0.2mL/孔接種96孔板（即2000個(gè)細(xì)胞/孔），于37℃、5% 二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d，10μL/孔加入MTT染色劑，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中放置2~4h，計(jì)數(shù)每塊平板有大集落LC和小集落SC生長(zhǎng)的孔數(shù)。試驗(yàn)樣品處理組和陽(yáng)性對(duì)照組每份培養(yǎng)物各設(shè)2個(gè)重復(fù)；陰性溶媒對(duì)照組設(shè)4個(gè)重復(fù)。

6、數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評(píng)價(jià)

數(shù)據(jù)處理方法和結(jié)果判定可參照：476 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)，化學(xué)品測(cè)試方法健康效應(yīng)卷（第二版），中國(guó)環(huán)境出版社，2013年（ISBN：978-7-5111-1476-1）；OECD 490等。

注：在染毒處理和表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后，均需對(duì)平板接種效率進(jìn)行測(cè)定，且要保證PE在70%~130之間，具體可參照國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行。

【注意事項(xiàng)】

1.實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)自行準(zhǔn)備RPMI 1640培養(yǎng)液、馬血清、丙酮酸鈉、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、滅菌槍頭、無(wú)菌移液管、二氧化碳培養(yǎng)箱、振蕩器、50mL離心管等，所有耗材需做無(wú)菌處理。

2.實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在符合細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)要求的環(huán)境下進(jìn)行。

3.細(xì)胞清除自發(fā)的突變使用的血清建議與正式試驗(yàn)血清同一廠家同一批號(hào)。

4.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。